Next Generation Sequencing

Die Hochdurchsatz-Sequenzierung, auch Next Generation Sequencing (NGS) genannt, ist eine moderne Technologie zur schnellen und präzisen Analyse der Gene eines Menschen. Sie ermöglicht eine detaillierte genetische Diagnostik und wird genutzt, um genetische Ursachen von Krankheiten zu identifizieren.

In der medizinischen Genetik kommen dabei je nach klinischer Fragestellung unterschiedliche Ansätze zum Einsatz, wie zum Beispiel die Panel-Sequenzierung und die Exom-Sequenzierung.

Bei der Panel-Sequenzierung wird nur eine gezielte Auswahl von Genen sequenziert (die Abfolge der DNA-Bausteine werden bestimmt), die mit bestimmten Erkrankungen in Verbindung stehen. Ein Panel umfasst eine definierte Anzahl an Genen, die für spezifische Krankheitsbilder relevant sind. Dieser Ansatz ist besonders sinnvoll, wenn bereits ein Verdacht auf eine bestimmte Erkrankung besteht und schnell gezielte Informationen zu den verantwortlichen Genen benötigt werden.

Bei der Exom-Sequenzierung wird das gesamte Exom – der Teil des Genoms, der die proteinkodierenden Gene enthält – sequenziert. Das Exom macht etwa 1-2 % des gesamten Genoms aus, enthält aber etwa 85 % aller bekannten krankheitsverursachenden Varianten. Dieser Ansatz ist besonders dann sinnvoll, wenn eine Erkrankung auf eine noch unbekannte genetische Ursache zurückzuführen ist.

Bevor eine DNA-Probe sequenziert werden kann, wird sie in einem ersten Schritt für die Sequenzierung vorbereitet. Dieser Schritt wird als Library Preparation bezeichnet. Dazu wird die DNA zunächst in kleine Fragmente (Stücke) zerlegt und mit speziellen Adaptern versehen, die für die Bindung an die Sequenziermaschine notwendig sind. Danach erfolgt eine gezielte Anreicherung der DNA-Fragmente mit den genetischen Zielregionen, die restlichen Fragmente (z. B. die nicht kodierenden Regionen) werden entfernt.

Die DNA-Sequenzierung wird anschließend mit leistungsfähigen Geräten wie dem NextSeq 2000 und den MiSeq von Illumina durchgeführt. Der Sequenzierungsprozess beginnt mit der Beladung der vorbereiteten DNA-Fragmente auf eine Flowcell (eine Trägeroberfläche für die Sequenzierung). Dort binden die Fragmente an spezifische Oberflächenstellen und es entsteht eine sogenannte Clusterbildung, bei der die Fragmente lokal vervielfältigt werden. Anschließend erfolgt die eigentliche Sequenzierung durch Synthese (SBS) – dabei wird der DNA-Strang Schritt für Schritt neu aufgebaut und gelesen. Bei jedem Schritt wird ein einzelnes Nukleotid, also ein DNA-Baustein, eingebaut und über einen Fluoreszenzfarbstoff erkannt. Ein Bild wird aufgenommen, um das fluoreszierende Signal jedes Nukleotids zu erfassen, und die Sequenz wird durch Auswertung der Farbsignale rekonstruiert. Die fertigen Sequenzdaten werden dann in Rohformaten (z. B. FastQ) gespeichert.

In der anschließenden bioinformatischen Analyse (eine computergestützte Auswertung biologischer Daten) werden diese Rohdaten durch komplexe bioinformatische Auswertungs-Algorithmen mit einem Referenzgenom verglichen und hinsichtlich Genveränderungen analysiert. Die gefundenen Genveränderungen werden anschließend mit Hilfe von Mutationsdatenbanken, in silico-Tools und aktueller wissenschaftlicher Literatur bewertet und in einem Befund zusammengefasst.