Next Generation Sequencing

Die Hochdurchsatz-Sequenzierung, auch als Next Generation Sequencing (NGS) bezeichnet, ist eine moderne Technologie zur schnellen und präzisen Analyse der Gene eines Menschen. Sie ermöglicht eine detaillierte genetische Diagnostik und wird genutzt, um genetische Ursachen von Krankheiten zu identifizieren.

In der medizinischen Genetik kommen dabei je nach klinischer Fragestellung unterschiedliche Ansätze wie die Panel-Sequenzierung und die Exom-Sequenzierung zum Einsatz.

Bei der Panel-Sequenzierung wird nur eine gezielte Auswahl von Genen sequenziert, die mit bestimmten Erkrankungen in Verbindung stehen. Ein Panel umfasst eine definierte Anzahl an Genen, die für spezifische Krankheitsbilder relevant sind. Dieser Ansatz ist besonders sinnvoll, wenn bereits ein Verdacht auf eine bestimmte Erkrankung besteht und schnell gezielte Informationen zu den verantwortlichen Genen benötigt werden.

Bei der Exom-Sequenzierung wird das gesamte Exom, also der Teil des Genoms, der die proteinkodierenden Gene umfasst, sequenziert. Das Exom macht etwa 1-2 % des gesamten Genoms aus, enthält aber etwa 85 % aller bekannten krankheitsverursachenden Varianten. Dieser Ansatz ist besonders dann sinnvoll, wenn eine Erkrankung auf eine noch unbekannte genetische Ursache zurückzuführen ist.

Bevor eine DNA-Probe sequenziert werden kann, wird diese in einem ersten Schritt (bei der sog. Library Preparation) für die Sequenzierung vorbereitet. Dazu wird die DNA zunächst in kleine Fragmente zerlegt und mit speziellen Adaptern versehen, die für die Bindung an die Sequenziermaschine notwendig sind. Danach erfolgt eine gezielte Anreicherung der DNA-Fragmente mit den genetischen Zielregionen, die restlichen Fragmente (z. B. die nicht kodierenden Regionen) werden weggewaschen.

Die DNA-Sequenzierung wird anschließend durch leistungsfähige Geräte wie den NextSeq 2000 und den MiSeq von Illumina durchgeführt. Der Sequenzierungsprozess beginnt mit der Beladung der vorbereiteten DNA-Fragmente auf eine Flowcell. Dort binden sie an spezifische Oberflächenstellen und es erfolgt eine Clusterbildung, bei der die Fragmente lokal amplifiziert werden. Anschließend erfolgt die eigentliche Sequenzierung nach der Sequenzierung durch Synthese (SBS). Sie basiert auf der schrittweisen Synthese eines komplementären DNA-Strangs während der Sequenzierung. Bei jedem Schritt wird ein einzelnes Nukleotid, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, in den wachsenden Strang eingebaut. Ein Bild wird aufgenommen, um das fluoreszierende Signal jedes Nukleotids zu erfassen, und die Sequenz wird durch Auswertung der Farbsignale rekonstruiert. Die fertigen Sequenzdaten werden dann in Rohformaten (z. B. FastQ) erfasst.

Bei der anschließenden bioinformatischen Analyse werden diese Rohdaten durch komplexe bioinformatische Auswertungs-Algorithmen mit einem Referenzgenom verglichen und hinsichtlich Genveränderungen analysiert. Diese Genveränderungen können dann nach ihrer klinischen Relevanz mit Hilfe von Mutationsdatenbanken, in silico-Tools und der aktuellen Literatur bewertet und in einem Befund zusammengetragen werden.